記憶障礙動物模型

引起動物的記憶障礙有多種方法，包括電休克、缺血缺氧、某些化學(xué)藥品等。對記憶障礙的測定則采用學(xué)習(xí)記憶的實(shí)驗(yàn)方法。在此先介紹常用的學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)法。

1 學(xué)習(xí)、記憶實(shí)驗(yàn)法(learn and memory test)

人們和動物的精神活動、心理狀態(tài)都是無法直接觀察到的。為了研究這些活動的發(fā)生過程，科學(xué)家們只能根據(jù)可觀察到的刺激反應(yīng)進(jìn)行推測。對腦內(nèi)記憶過程的研究只能從人類或動物學(xué)習(xí)或執(zhí)行某項(xiàng)任務(wù)后間隔時(shí)間，測量他們的操作成績或反應(yīng)時(shí)間，由此來衡量這些過程的編碼形式、儲存量、保持時(shí)間以及它們所依賴的條件等。學(xué)習(xí)、記憶實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)是條件反射，各種各樣的方法均由此衍生而來。現(xiàn)簡介常用的動物學(xué)習(xí)、記憶實(shí)驗(yàn)方法。

1.1 跳臺法(step down test)

(1)實(shí)驗(yàn)方法  大鼠和小鼠跳臺法均較常用。

實(shí)驗(yàn)裝置為1只長方形實(shí)驗(yàn)箱，箱內(nèi)用黑色塑料板分隔成獨(dú)立的5個(gè)小間，每個(gè)小間的規(guī)格為12cm×12cm×20cm(小鼠)或23cm×25cm×40cm(大鼠)。反射箱底部是間距為1cm的銅柵，可以通電，電壓強(qiáng)度可由一變壓器調(diào)控，一般采用40V電壓。每間內(nèi)有一可自由移動的、高和直徑均為4.5cm的平臺(小鼠)或高為5cm、直徑為8cm(大鼠)，一般置于左后或右后角。

將動物放入反射箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后予以通電。動物受到電的刺激后，其正常反應(yīng)是尋找躲避傷害性刺激的可能，因此很快會跳上平臺。多數(shù)動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電的刺激后又迅速跳回平臺，如此訓(xùn)練5min，記錄儀將記錄每鼠受到電的刺激的次數(shù)或叫錯(cuò)誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重作測試：將小鼠放在平臺上，然后予以通電，動物自平臺跳至銅柵上的時(shí)間為次跳下平臺的潛伏期，此即記憶保持測驗(yàn)。記錄受到電的刺激的動物數(shù)、每鼠次跳下平臺的潛伏期和3min內(nèi)的錯(cuò)誤總次數(shù)。

(2)模型特點(diǎn)和比較醫(yī)學(xué)  該模型屬回避性條件反射實(shí)驗(yàn)，本法簡便易行，一次可同時(shí)測試5只動物。既可觀察藥物對記憶過程的影響，也可觀察對學(xué)習(xí)的影響，敏感性較高，適合對藥物的初篩。缺點(diǎn)是動物的回避性反應(yīng)差異較大，可采取對動物進(jìn)行預(yù)選的方法以減少差異性。跳臺法在受到電的刺激前如果施以條件刺激，則可同時(shí)觀察被動和主動回避性反應(yīng)。

1.2 避暗法(step through test)

(1)實(shí)驗(yàn)方法  此法是利用鼠類的嗜暗習(xí)性而設(shè)計(jì)的，常用動物為小鼠。

實(shí)驗(yàn)裝置包括明、暗兩室。小鼠明室大小為11cm×3.2cm，其上方約20cm處有1盞白熾燈照明，暗室大小為17cm×3.2cm。兩室之間隔板底部有1個(gè)直徑為3cm的圓洞。兩室底部均為銅柵，暗室內(nèi)的銅柵可以通電。電壓強(qiáng)度可由一變壓器調(diào)控，一般采用40V電壓。暗室與一計(jì)時(shí)、計(jì)數(shù)器相連，可自動記錄動物由明室進(jìn)入暗室的潛伏期和進(jìn)入暗室的次數(shù)。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠背朝洞口放入明室，同時(shí)啟動計(jì)時(shí)、計(jì)數(shù)器。動物穿過洞口進(jìn)入暗室即受到電的刺激，此即小鼠次由明室進(jìn)入暗室受到電的刺激所需的時(shí)間(潛伏期)，取出小鼠。24h后再次測試，記錄動物進(jìn)入暗室的潛伏期、5min內(nèi)的電的刺激次數(shù)和受到電的刺激的動物數(shù)。

(2)模型特點(diǎn)  該模型也屬于回避性條件反射實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法簡便易行，以潛伏期作為指標(biāo)，其準(zhǔn)確度高于跳臺法，對記憶過程特別是記憶再現(xiàn)有較高的敏感性。大量研究資料顯示，小鼠的平均潛伏期約十幾秒，訓(xùn)練期接受一次受到電的刺激后，記憶的保持可持續(xù)l周之久。

1.3 迷津(maze)

迷津的種類和裝置繁多，但不外乎由3個(gè)基本部分組成：起步區(qū)、跑道或稱路徑、目標(biāo)區(qū)(放置食物或安全區(qū))。動物由起步區(qū)開始訓(xùn)練，經(jīng)過復(fù)雜的路徑尋找過程，終到達(dá)目標(biāo)區(qū)。正常動物經(jīng)過訓(xùn)練，可很快到達(dá)目標(biāo)區(qū)。而記憶障礙動物，此過程明顯長于正常對照的動物。迷津包括Y型迷路、水迷路和Morris迷津。

1.Y型迷路(Y-maze)

(1)實(shí)驗(yàn)裝置  該裝置一般分成三等份，分別稱之為Ⅰ臂(中間臂，為起步區(qū))、Ⅱ臂(右側(cè)臂，為電的刺激區(qū)，與電刺激器相連)、Ⅲ臂(左側(cè)，為安全區(qū))。

(2)實(shí)驗(yàn)動物  健康小鼠，體重為20～22g。

(3)實(shí)驗(yàn)方法  在此介紹兩種訓(xùn)練方法。

種：將動物放入起步區(qū)，操縱電的刺激控制器訓(xùn)練小鼠遭遇電的刺激時(shí)直接逃避至左側(cè)安全區(qū)為正確反應(yīng)，反之為錯(cuò)誤反應(yīng)。訓(xùn)練方法有以下三種：①固定訓(xùn)練10～15次，記錄正確和錯(cuò)誤反應(yīng)的次數(shù)。②動物在連續(xù)獲得二次正確反應(yīng)前所需的電的刺激次數(shù)。③動物的學(xué)習(xí)成績達(dá)到9/10次正確反應(yīng)前所需的電的刺激次數(shù)。24h后測驗(yàn)動物的記憶成績。此法簡單、屬一次性訓(xùn)練的空間辨別反應(yīng)試驗(yàn)。

第二種：按上述方法訓(xùn)練完成后，將Ⅱ臂改為起步區(qū)，動物在遭遇電的刺激后直接逃至T臂(左側(cè))為正確反應(yīng)，逃至Ⅲ臂(右側(cè))則為錯(cuò)誤反應(yīng)。訓(xùn)練達(dá)到要求后，再將Ⅲ臂改為起步區(qū)，動物于電的刺激后逃至左側(cè)(Ⅱ臂)為正確反應(yīng)，逃至右側(cè)(Ⅰ臂)為錯(cuò)誤反應(yīng)。以動物在三臂訓(xùn)練均達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)所需電的刺激次數(shù)的總和作為學(xué)習(xí)成績。24h或48h后測定動物的記憶成績。

(4)注意事項(xiàng)  ①如果在目標(biāo)區(qū)放置食物，則動物于實(shí)驗(yàn)前需禁食，以使其體重減至原體重的85％，這樣動物才具有攝食的驅(qū)動力。②在目標(biāo)區(qū)停留的時(shí)間不能太短暫，否則失去強(qiáng)化效果。③每天訓(xùn)練結(jié)束后需清洗實(shí)驗(yàn)箱，以消除動物留下的氣味。④每天訓(xùn)練次數(shù)以10～15次為宜。

2.水迷路(water maze)

水迷路的種類很多，在此介紹一種較復(fù)雜的水迷路。如圖13-1所示：S為起步區(qū)，F(xiàn)為目標(biāo)區(qū)。在目標(biāo)區(qū)有一爬梯，動物可爬出水面而獲得休息。此爬梯可移至圖13-1B中的“1”和“2”的位置，分別是指訓(xùn)練第1日和第2日爬梯放置的位置，即為第1日訓(xùn)練動物游至1處，第2日訓(xùn)練動物游至2處。現(xiàn)已有中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制造的“水迷宮程序自動控制儀”供選用。

3.莫里斯水迷津(Morris water maze test)

20世紀(jì)80年代初，英國心理學(xué)家Morris等利用大鼠在盛有水和牛奶混懸的不透明的水池中搜尋目標(biāo)物的方法，研究大鼠的海馬等腦區(qū)受到損害后的學(xué)習(xí)、記憶能力的變化，取得了令人矚目的結(jié)果。這種裝置可觀察并記錄動物入水后搜尋目標(biāo)所需時(shí)間、采用的策略和它們的運(yùn)動軌跡，有助于分析和推斷動物的學(xué)習(xí)、記憶、空間定向以及認(rèn)知功能等方面的能力。現(xiàn)已較廣泛采用，稱之為莫里斯水迷津法。

(1)實(shí)驗(yàn)裝置  該實(shí)驗(yàn)裝置由黑色塑料圓桶、攝像頭、視頻采集卡、視頻分析軟件和計(jì)算機(jī)等構(gòu)成。用于大鼠實(shí)驗(yàn)：圓桶直徑為160cm、高為45cm、水池的水深為40cm；用于小鼠實(shí)驗(yàn)：圓桶直徑為120cm、高為40cm、水池的水深為30cm。水池內(nèi)有一站臺，站臺直徑對小鼠實(shí)驗(yàn)為6cm、對大鼠實(shí)驗(yàn)為9cm。在圓桶的上緣等距離地設(shè)東、南、西和北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，作為動物進(jìn)水池的入水點(diǎn)。以這4個(gè)入水點(diǎn)在水面和圓桶底部的投影點(diǎn)，將水面和圓桶部分分成均等的4個(gè)象限。按實(shí)驗(yàn)要求，可地將站臺放置于某一象限的中間(圖13-2)。

(2)實(shí)驗(yàn)方法  實(shí)驗(yàn)前將圓桶灌以清水至預(yù)定的水池高度，再加入適量的黑色顏料(白色鼠)或奶粉(黑色鼠)，使水池成為不透明狀。水溫控制在23～25℃之間。將站臺放置在水池的預(yù)定部位，作為動物入水后搜索的目標(biāo)。站臺的頂端平面應(yīng)低于水面2cm，這樣動物憑視覺無法辨認(rèn)水池中有無站臺。實(shí)驗(yàn)程序如下：

1)訓(xùn)練方法  每只動物每天訓(xùn)練4次。每天將動物按東、南、西和北4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將動物頭朝池壁輕輕地放入水中。同時(shí)開啟視頻采集系統(tǒng)，此系統(tǒng)將采集動物自入水到找到站臺后四肢爬上站臺時(shí)所需要的時(shí)間，即潛伏期。同時(shí)記錄動物入水后的游泳軌跡，并分析動物在水中活動的總時(shí)間、總路程、上臺前路程、潛伏期、分別在4個(gè)象限的活動時(shí)間和路程、分別在站臺周圍Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ區(qū)域內(nèi)的活動時(shí)間和路程等多項(xiàng)指標(biāo)。

動物爬上站臺后，讓動物在站臺上站立10s。若動物入水后在60s內(nèi)未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺，可將動物放置于站臺上站立10s。然后將動物從站臺上拿下來。休息30～60s以后，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。

一般情況下，正常動物或服用促智藥物的動物在經(jīng)過5～6個(gè)實(shí)驗(yàn)日的訓(xùn)練后很快就學(xué)會以丨快丨佳的軌跡搜索到站臺的位置。此階段的實(shí)驗(yàn)稱之為定位航行實(shí)驗(yàn)。

2)撤臺實(shí)驗(yàn)  第6或第7個(gè)實(shí)驗(yàn)日將站臺撤除，并將動物從池壁的一點(diǎn)面朝壁輕輕放入水中。正常動物會在站臺的原來位置不斷尋找，表現(xiàn)為穿過站臺原有位置的次數(shù)明顯增多以及在站臺周圍活動的時(shí)間明顯延長。而智力障礙的動物穿過站臺原有位置的次數(shù)明顯減少，或在水中呈現(xiàn)無目標(biāo)的游泳。此階段的實(shí)驗(yàn)稱之為空間探索試驗(yàn)。

(3)模型特點(diǎn)  影響該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，其中以實(shí)驗(yàn)環(huán)境較為重要。實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備、儀器、工作臺、椅子、門窗和燈具等陳設(shè)的位置和實(shí)驗(yàn)操作者所站立的位置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均需固定，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)閯游锍３脤?shí)驗(yàn)室內(nèi)固有的環(huán)境作為它搜索目標(biāo)時(shí)的參照物。由于莫里斯水迷津的水容量大，所以動物的排泄物和所分泌的外激素不會影響其他動物的作業(yè)成績，這一特點(diǎn)優(yōu)于其他的動物行為試驗(yàn)方法。

(4)比較醫(yī)學(xué)  莫里斯水迷津法操作簡便，方法可靠。藥物、神經(jīng)毒素、血管性癡呆以及多種因素引起的記憶障礙動物模型，均可使動物的潛伏期延長，撤臺實(shí)驗(yàn)時(shí)穿越原有站臺位置的次數(shù)明顯減少，并可引起定向障礙和運(yùn)動軌跡混亂。而有效的促智藥物可使?jié)摲诳s短，增強(qiáng)動物的定向能力，從而能提前達(dá)到學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)。因此，奠里斯水迷津法可用來檢驗(yàn)神經(jīng)藥物對動物的學(xué)習(xí)、記憶和定向能力的影響，并可用來篩選促智藥物。

2 記憶障礙動物模型

回避性條件反射方法雖已得到廣泛應(yīng)用，但動物經(jīng)一次訓(xùn)練即可學(xué)會逃避電的刺激，且很快趨于鞏固，并可維持相當(dāng)長一段時(shí)間。在這種情況下觀察藥物改善學(xué)習(xí)記憶的作用是困難的，即使受試物有很好的藥效，但由于組間差異甚小，因此也是無法通過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的。現(xiàn)研究者通常采用記憶缺失的動物模型，這不但有助于評定藥物的作用，還可以初步分析藥物的作用機(jī)制。

(1)實(shí)驗(yàn)方法  完整的記憶過程包括記憶獲得、鞏固與再現(xiàn)三個(gè)階段。不同類型的記憶障礙模型可分別觀察藥物對上述三個(gè)階段的影響。形成記憶障礙的方法很多，主要有：電休克，腦部缺血、缺氧，某些化學(xué)藥品，應(yīng)激，剝奪睡眠，老年動物以及有遺傳缺陷的動物等。下面分別介紹記憶獲得障礙、記憶鞏固障礙和記憶再現(xiàn)缺失動物模型的形成方法。

1)記憶獲得障礙  抗膽堿能藥物影響記憶的機(jī)制比較清楚，結(jié)果且易于重復(fù)，并且無明顯非特異性作用，用此類藥物來造成記憶獲得障礙模型是較為理想的，因此在國內(nèi)外得到廣泛采用。常用的抗膽堿藥物是東莨菪堿，其次為樟柳堿。于訓(xùn)練前30min經(jīng)腹腔注射給藥一次，劑量為2～4mg/kg體重，可顯著破壞動物學(xué)習(xí)和記憶的獲得。利血平、戊丨巴丨比丨妥丨鈉、氯丙嚓、利丨眠丨寧等中樞抑制劑均可明顯抑制記憶的獲得。

2)記憶鞏固障礙  常用的方法有電休克，缺氧和給予蛋白質(zhì)合成抑制劑等。

①電休克：動物訓(xùn)練結(jié)束后立即將電極接于其頭部和鼻部，給予一強(qiáng)度為7mA的電流刺激，持續(xù)1s，24h后重作測驗(yàn)，動物的記憶將不再保持。

②缺氧：造成缺氧的方法有以下幾種：訓(xùn)練后立即將小鼠置于密閉的罐子里，通以96.2％N2和3.8％O2的混合氣體，直至動物倒地意識喪失時(shí)為止；給動物吸入純CO2；皮下注射NaNO2(120mg/kg體重)。這些方法均可破壞記憶的鞏固。

③蛋白質(zhì)合成抑制劑；常用的藥物有環(huán)己酰亞胺、氯霉素、茴香霉素等。其中以環(huán)己酰亞胺的作用易于重復(fù)，結(jié)果可靠。用藥劑量為120mg/kg體重，于訓(xùn)練后立即或訓(xùn)練*min腹腔注射一次，即可破壞記憶的鞏固。

3)記憶再現(xiàn)缺失  經(jīng)訓(xùn)練的小鼠于重測前30min經(jīng)腹腔注射40％～45％乙醇(0.1ml/10g體重)，可明顯干擾記憶的再現(xiàn)。乙醇價(jià)廉易得，結(jié)果穩(wěn)定，易于重復(fù)，對中樞和一般運(yùn)動功能無明顯影響。但其影響記憶的機(jī)制還不清楚。

(2)給藥方案  采用不同的給藥方案和不同類型的記憶障礙模型，可分別觀察藥物對學(xué)習(xí)效應(yīng)和記憶不同階段的影響，從而可更地了解受試藥物作用的性質(zhì)和特點(diǎn)。可采取訓(xùn)練前、訓(xùn)練后以及重測前給藥的方法。

訓(xùn)練前給藥：于訓(xùn)練前幾天給藥可觀察藥物對長期學(xué)習(xí)效應(yīng)的影響；訓(xùn)練前數(shù)分鐘內(nèi)給藥可觀察藥物對學(xué)習(xí)成績和記憶獲得的影響。

訓(xùn)練后給藥：于訓(xùn)練后立即或短時(shí)間內(nèi)給藥可觀察藥物對記憶鞏固作用的影響，訓(xùn)練后幾天繼續(xù)給藥可觀察藥物對記憶保持的作用。

重測前給藥：經(jīng)過訓(xùn)練，動物于重測前數(shù)分鐘內(nèi)給藥可觀察藥物對記憶再現(xiàn)的影響。

但上述給藥方案不是的。有些學(xué)習(xí)、記憶實(shí)驗(yàn)，動物需經(jīng)過多次或多天訓(xùn)練才能學(xué)會執(zhí)行某一操作(如莫里斯水迷津)。因此，藥物的效果很可能是對學(xué)習(xí)、記憶獲得和記憶保持的綜合作用結(jié)果。

(3)注意事項(xiàng)  學(xué)習(xí)、記憶試驗(yàn)應(yīng)在隔音室或半隔音室內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)要保持環(huán)境安靜，室內(nèi)溫度、濕度和光照度應(yīng)適宜并保持一致；實(shí)驗(yàn)前數(shù)天將動物移至實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)周圍環(huán)境；實(shí)驗(yàn)者需每天接觸動物如喂水、喂食和撫摸動物，實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇適宜時(shí)間進(jìn)行，每天的實(shí)驗(yàn)要在同一時(shí)間內(nèi)完成。

(4)結(jié)果評價(jià)  一個(gè)藥物是否有效，至少要滿足以下幾個(gè)條件：①結(jié)果經(jīng)得起重復(fù)。②藥物有量一效關(guān)系或其作用規(guī)律。③在不同類型實(shí)驗(yàn)方法和不同類型動物模型中均顯示效果，并且在作用性質(zhì)和方向上相吻合。

對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果需進(jìn)行綜合分析。因?yàn)樗幬锿哂卸喾矫娴淖饔茫械淖饔靡谆洃涍^程，而有的作用則阻抑記憶過程；或在給藥后不同時(shí)間分別產(chǎn)生不同的作用，以致在某一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)記憶改善，而在隨后的某一時(shí)間內(nèi)記憶減弱；并且同一藥物在腦的不同部位可產(chǎn)生不同的作用。另外，某些藥物在動物種屬產(chǎn)生陽性結(jié)果，而在另一些動物種屬則無效，這些都是應(yīng)該在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)需要綜合考慮到的因素。